1.分析斑马鱼目标基因的基因组组成(外显子-内含子结构),然后针对该基因,设计阻
遏原始转录本剪接的吗啡啉(morpholino)(MO-Spl)。
注:MO-spl 不能阻止母源转录本的翻译,如果要阻止母源转录本的翻译,需要设计阻遏原
始转录本翻译的吗啡啉(MO-Atg)。
2.订购吗啡啉 MO-Spl 或 MO-Atg 和标准对照 MO。
3.将不同浓度的 MO-Spl 注射入斑马鱼受精卵(标准对照 MO 仅注射最高浓度)
4. 待注射胚胎发育至特定时期(优选 48 hpf 前的某些时期),收集胚胎,提取总 RNA,
然后进行体外转录(RT)。
5.按3已建立的方法进行 RT-PCR 扩增,确认目标基因的原始转录本的正常剪接是否
被阻遏(发生异常剪接)。同时,设置检测管家基因表达作为内参对照,确认整个 RT-PCR
过程正常。
注:如果是使用 MO-Atg,则无简单易行的有效性检测方法(一般不做有效性检测,仅开展
特异性检测)。
6. 分析 5的实验结果,确定 MO 敲降工具的有效性,以及实现有效敲降的最低注射
浓度