外泌体在分泌细胞和受体细胞间的穿梭介导了细胞间的生物分子传递，是不同组织细胞间信息沟通的重要媒介，外泌体通过携带来自分泌细胞的多种RNA，蛋白和脂成分，参与广谱的生理和病理过程，包括炎症反应、肿瘤转移、心血管疾病等。

外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。经质谱鉴定发现不同来源外泌体携带了4400余种特异性蛋白质。而蛋白质差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点也是研究外泌体的重要途径。但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋白质的研究将具有巨大的前景。

外泌体的分离纯化

外泌体的分离和纯化是外泌体蛋白质组学研究的前提。外泌体的提取方法包括TiO2富集法、超速离心法和试剂盒法等，每种方法各有其优缺点，方法的不同对所提纯的外泌体大小，形态，密集程度等有所影响。

TiO2富集法：外泌体在TiO2表面化学吸附的驱动力是磷脂双分子层上的磷酸基团和TiO2之间的配位键。由于磷脂双分子层的柔韧性，可以弯曲以促进与TiO2表面的多位点相互作用，因此可以实现特定而牢固的结合。由于其简单性和高度的亲和力，这种基于共价结合的选择性富集方法，具有富集效率高，非特异性吸附少，样品处理时间短等方面的优势。

超速离心法：超速离心分离外泌体是目前使用最为广泛的一种方法，也是目前公认的金标准。其原理是根据外泌体与细胞不同组分的沉降系数不同，利用不同强度离心力使样品中死亡细胞、细胞碎片、细胞器等组分被分离出去，然后获得外泌体及部分受到污染的蛋白，用PBS再次重悬清洗离心后即可获得实验所需外泌体。超速离心的优点是能够大量处理样本，且与其他方法相比提取的外泌体形态及后续的外泌体鉴定与经典文献描述相似，因此是目前公认的提取外泌体最有效可靠的方法。

细胞样本：细胞样本的培养基使用量取决于细胞系以及培养状况，细胞系不同外泌体的释放量有很大差别，外泌体释放量高的细胞系几毫升培养液就足够；释放量低的则需要上百毫升。一般来说一个普通的细胞系，用超离分离外泌体，预实验（摸索条件）起始培液量50ml以上（直接正式实验建议100-500ml）。细胞培养过程中可以使用无外泌体血清培养基培养，也可以使用含有外泌体的血清培养细胞到一定密度（70-80%），然后吸去培养液，PBS洗数次之后换无血清培液进行培养（建议无血清培养48h后收集细胞上清）。

血液样本：目前认为血清中外泌体的含量还是很高的，用促凝管或者抗凝管收集全血3000rpm 4℃ 离心10min，取上清，液氮速冻，保存于-80℃，一般需要3-5ml的血浆/血清样本。

试剂盒法：近年出现了各种用于分离纯化外泌体的商品化试剂盒，目前最常用的是由SystemBiOsciences（SBI）研发的EXOQuick试剂盒，该系列的试剂是基于多聚体形式的Exosome提取试剂，形成类似于网状结果，将一定直径的微泡捕获出来，快速有效的提取各种体液样本中Exosome。

外泌体的表征 

2015国际细胞外囊泡协会指南中给定了这三个实验联合鉴定外泌体的方法。三个实验是相互佐证的 使用电镜来观察你的样品中是否有与外泌体相似的经典结构，有经典结构说明你的样品中有外泌体或者与外泌体类似的如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构；纳米颗粒追踪分析技术( nanoparticle tracking analysis，NTA)检测外泌体大小以及数量；WB检测发现样品中具有外泌体的标志物，那就一定程度上排除了溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况。

三种方法鉴定纯化的外泌体：A.电镜；B.NTA; C.Weston Blot