基因敲除原理 我们是利用CRISPR/Cas9基因敲除系统，CRISPR是一种来源于细菌免疫系统的基因编辑技术，能精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶蛋白对DNA靶点序列进行切割，产生双链DNA断裂，断裂将在体内被细胞修复机制修复，其中，非同源末端连接NHEJ这种修复将产生短的核酸插入或删除，其带来的基因移码突变，将导致提前出现终止密码子，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游设计sgRNA后，通过构建基因敲除载体，结合慢病毒系统，可以实现外源基因的整合，利用抗生素或荧光，最终筛选出成功实现基因敲除的细胞。 CRISPR/Cas9基因敲除系统服务优势： （1）广泛适用于哺乳动物细胞，脱靶率更低 （2）提高转染率，减低细胞毒性，缩短实验周期 基因敲除细胞株的项目流程： （1）项目评估（免费） （2）细胞抗生素敏感浓度摸索与单克隆形成验证 （3）sgRNA设计与敲除载体构建 （4）慢病毒包装与转染 （5）阳性多克隆筛选 （6）阳性单克隆筛选 （7）敲除验证 基因敲除服务周期：根据细胞生长特性与基因不同，服务周期在5～10周不等。 服务流程：                      客户提供：靶细胞及其培养方案、基因名称 交付标准：1×基因敲除阳性单克隆细胞株（复苏）                   1×项目结题报告 服务保证： （1）项目启动后，密切跟进实验进展，每两周进行一次项目进度汇报。 （2）项目结题报告包含sgRNA序列、实验详细记录、测序结果及分析等，满足客户后期论证材料需求。 （3）基因敲除阳性单克隆均经过靶标片段T载体克隆测序验证，保证基因敲除。 【案例分享】CRISPR/Cas9基因敲除细胞株构建 1 抗生素敏感浓度摸索‍‍ 将细胞如下图1稀释。给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。                                       图1 抗性浓度摸索 2 单克隆形成验证 细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。 3 靶标基因sgRNA 设计 根据基因序列信息，设计 sgRNA。 4 位点序列信息确认 PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。                                 图2 靶标序列扩增 5 敲除载体构建 退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。 每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取效果（图3）。                                             图3 质粒抽提 酶切验证 ：取3个单克隆酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。选择2个样品送样测序。                                图4 单克隆酶切验证 6 慢病毒包装 敲除载体无内毒素质粒提取，病毒包装。 7 细胞转染 配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。 8 阳性多克隆细胞株筛选 9 阳性单克隆细胞株筛选 细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。  10 阳性单克隆细胞株验证 1、测序验证 提取阳性单克隆细胞株的基因组，将靶标基因酶切克隆至T载体后测序，以确定是否敲除成功。 实验结果示例： 该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。 单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。 单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。