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DeepBio得分:5567.2
DeepBio得分
是基于文献引用次数，影响因子，文献新近度等因素计算的客观产品评级，得分越高表明该产品经过越可靠的实验验证，质量可信度越高
CRISPR EDITx™ KO 极速敲除试剂盒
【产品名称】CRISPR EDITx™ KO 极速敲除试剂盒
【储存条件及有效期】
有效期1年，保存条件-20°C；如长期储存，建议置于-80°C。干冰运输
建议根据使用次数进行分装，避免反复冻融。
【产品简介】
CRISPR EDITx™ KO 极速敲除试剂盒是一款科研级的即用型CRISPR敲除试剂盒。该产品包含艾迪基因创新研发的CRISPR EDITx™Tran转染试剂以及经数千例实战验证过的Cas酶，为科研工作者提供一种快速高效的基因敲除工具。
CRISPR EDITx™Tran转染试剂是一种基于生物分子辅助递送Cas蛋白和gRNA系统的转染试剂。该转染试剂无细胞毒性，只需与细胞孵育30分钟，即可与Cas-gRNA复合物成功转染至细胞，实现强大的基因编辑能力。
l 高效转染：采用创新研发的CRISPR EDITx™ Tran转染试剂,30min转染，48h检测编辑效率。
l 高效编辑：结合高效转染试剂、经市场验证的Cas酶以及独特gRNA设计逻辑，敲除效率高达95％
l 细胞毒性级低：生物分子辅助Cas-gRNA系统递送转染，进入细胞后迅速释放DNA，并快速降解。
l 普适性强：适用于多数细胞，对于难转染细胞、生长代数受限细胞更有优势。
l 设备要求低：生物分子辅助递送，实现高效编辑，无需电转仪等仪器。
注：使用该产品发表文章时，请标注我司名称Guangzhou Editgene Co., Ltd, China，CRISPR EDITx™ KO kit （CAS：EDKO-K03）
【产品组分】
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产品名称 |
组分 |
规格 |
货号 |
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CRISPR Editx™KO 极速敲除试剂盒-基础版
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CRISPR EDITx™Tran转染试剂 |
30μL*5 |
30μL*10 |
30μL*25
|
EDKO-K01 |
|
Cas12a核酸酶（100μM） |
20uL |
40uL |
100uL |
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产品名称 |
组分 |
规格 |
货号 |
||
|
CRISPR Editx™KO 极速敲除试剂盒-加强版 |
CRISPR EDITx™Tran转染试剂 |
30uL*5 |
30uL*10 |
30uL*25
|
EDKO-K02 |
|
Cas12a核酸酶（100μM） |
20uL |
40uL |
100uL |
||
|
crRNA（1.5nmol， dilute to100μM） |
20-30uL |
40-60uL |
100-150uL |
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产品名称 |
组分 |
规格 |
货号 |
|||
|
CRISPR Editx™KO 极速敲除试剂盒-完全版 |
CRISPR EDITx™Tran转染试剂 |
30uL*5 |
30uL*10 |
30uL*25
|
EDKO-K03 |
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|
Cas12a核酸酶（100uM） |
20uL |
40uL |
100uL |
|||
|
crRNA（1.5nmol， dilute to100μM） |
20-30uL |
40-60uL |
100-150uL |
|||
|
DNA Lysis |
Buffer A |
1mL |
2mL |
5mL |
||
|
Buffer B |
20μL |
40μL |
100μL |
|||
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PCR Validation |
2x High Fidelity Pfu Mix (+Dye) |
300μL |
600μL |
1500μL |
||
|
Genotyping Primer F |
20μL |
40μL |
100μL |
|||
|
Genotyping Primer R |
20μL |
40μL |
100μL |
|||
【需准备其他实验材料】
1. 合成的crRNA （根据Cas12a设计骨架，可以使用脱盐级crRNA，使用HPLC级别效果更佳，如果定制加强版/完全版则无需准备）
2. Opti-MEM I Reduced Serum Medium
3. RNase-free EP管和枪头等
【实验步骤】
1. 细胞培养和铺板（以24孔板为例）
请使用适当保存和经常传代的健康细胞，并确保培养基无细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。在进行转染前，可参考表1进行细胞铺板。
注意：本方法不需要抗性筛选，因此无需添加抗生素。
|
|
24-well |
|
细胞数/孔 |
4~15x104 |
2. 细胞转染
2.1配置RNP混合物
转染前24h确认每孔细胞融合度达 40%~60%（如表1推荐的细胞数量），按表2建议，取EP管将 Cas12a酶和 crRNA 混合到Opti-MEM I Reduced Serum Medium培养液中，用枪头混匀，避免产生气泡，称为管1，室温孵育15min。
|
|
24-well |
终浓度 |
|
crRNA |
2.4uL |
8 μM |
|
Cas12 nuclease |
3uL |
10 μM |
|
Opti-MEM™ I Medium |
Add to 30μL |
|
|
孵育30min |
||
2.2配置转染复合物
取管1复合物至含30μL CRISPR EDITx™Tran转染试剂的管2，轻轻混匀，室温孵育5min
2.3转染目的细胞
PBS清洗细胞2次，吸干上清，加入转染复合物，37℃孵育30 min，更换完全培养基。
3. 分析转染细胞
转染48h，提取细胞基因组，进行基因编辑效率分析。
3.1pool切割效果检测
① 将 Pool 中 1个复孔的细胞用 PBS 冲洗后，胰酶消化，离心收集细胞，弃上清。
② 按照 1×105~106Cell/mL DNA Lysis 的比例加200 μL DNA Lysis BufferA吹打混匀，加4 μL DNA Lysis BufferB涡旋振荡混匀后，55℃水浴10 min，95℃水浴5 min。
③ 12000 rpm离心5 min，取150 μL上清，上清液即可用于PCR反应。
④ 取 2 μL Pool 的裂解液做模板，按表 1 和表 2 配制 PCR 体系。
表1.实验样品配制体系
|
试剂 |
体积（每反应） |
|
2x High Fidelity Pfu Mix (+Dye) |
25μL |
|
单克隆细胞裂解产物 |
2μL |
|
Genotyping Primer F |
1μL |
|
Genotyping Primer R |
1μL |
|
ddH2O |
21μL |
|
总体积 |
50μL |
⑤ PCR 上机反应，程序如下表：
表 2. PCR 鉴定程序
|
步骤 |
温度 |
时间 |
循环 |
|
预变性 |
95℃ |
3min |
1 cycle |
|
循环扩增 |
95℃ |
15s |
35 cycles |
|
60℃（根据引物Tm值设置） |
15s |
||
|
72℃ |
1 min/kb |
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|
延伸补偿 |
72℃ |
5min |
1 cycle |
⑥ PCR 产物直接点样3μL跑琼脂糖凝胶电泳（不需加 Loading Buffer），若 Pool 裂解产物 PCR 条带为单一条带且与设计理论值条带大小相符，则可直接送PCR 产物进行Sanger测序。
3.2单克隆鉴定
与pool切割效果检测步骤一致。
应用案例
1.项目信息
细胞名称：THP-1细胞
基因：B2M
2.crRNA设计
B2M基因编辑位点图示
crRNA: UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCAUUCUCUGCUGGAUGACGU （骨架20bp、全长40bp）
注：下划线部分为Cas12a的crRNA骨架。
3.转染步骤
参考上述实验步骤2
4.编辑效率检测
转染48h，收集细胞进行编辑效率检测，ICE Analysis显示编辑效率约为95%。
B2M测序结果
ICE Analysis结果
部分测试细胞清单
|
细胞类型 |
细胞来源 |
敲除效率 |
|
THP-1 |
人单核细胞白血病系 |
★★★★★ |
|
Hela |
人宫颈癌细胞系 |
★★★★★ |
|
A549 |
人非小细胞肺癌系 |
★★★★★ |
|
C2C12 |
小鼠成肌细胞系 |
★★★★★ |
|
MDA-MB-231 |
人乳腺癌细胞系 |
★★★★ |
|
SNU-449 |
人肝癌细胞系 |
★★★★ |
|
H1975 |
人肺腺癌细胞系 |
★★★★ |
|
LLC |
小鼠lewis肺癌细胞系 |
★★★ |
|
Kupffer |
小鼠肝固有巨噬细胞系 |
★★★ |
|
BV2 |
小鼠胶质细胞系 |
★★★ |
|
RAW264.7 |
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系 |
★★★ |
|
DC2.4 |
小鼠骨髓树突状细胞系 |
★★★ |
*敲除效率（%）：★★★★★＞70％，★★★★＞50％，★★★＞30％
常见问题
1. 如何确认该试剂盒的转染效果？
答：该试剂盒中的cas酶含有GFP标签，可通过荧光显微镜观察是否转入细胞内。孵化30min后即可观察到荧光，如果时间超过12h，可能就无法观察到荧光。
2. 是否可以使用其他公司的酶搭配使用？
答：试剂盒中的cas酶是艾迪基因多年研发的成果，均经过特殊改造，所以不能用其他的酶替代。
3. 如何设计crRNA？
答：该系统使用的是cas12a。
实例：crRNA: UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCAUUCUCUGCUGGAUGACGU （骨架20bp、全长40bp）
注：下划线部分为Cas12a的crRNA骨架。
4. 为什么选择cas12a，而不是cas9，Cas12a的附属切割活性是否会影响其他基因？
答：因为cas12a的crRNA只有40bp，合成更容易，而且成本低；艾迪基因前期测试了cas12a；后期也会测试cas9。
Cas12a的附属切割活性不会影响其他基因，因为对靶标基因切割后，cas12a一样从激活状态失去切割能力。
5. 该方法为何对细胞的损伤比较小？
答：该方法使用的是生物分子，不会像化学转染法有毒性，或者电转法对细胞产生伤害。
6. 如果敲除失败如何处理？
答：如果通过试剂盒敲除失败，艾迪基因不收费，所有试剂盒的费用可以转为在艾迪基因定制基因敲除的服务费用。
| 好评度 | 商品满意度 | 服务满意度 | 发货满意度 |
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