Y187菌株是GAL4系统酵母单双杂实验常用菌株,MATa型,可直接转化质粒,也可以与 MATa型酸母菌株(Y2HGold,AH109等)通过 mating操作进行筛库实验。筛选标记为:tml,leu2,报告基因为:
lacZ,MEL1。Y187-pHis2 系统酵母单杂需要pHis2和pGADT7-Rec2两种质粒配套使用。质粒pHis2的筛选标志为Trp,用于表达pBait-His2 construct(1~3 个bait DNA序列重复串联后克隆到 pHis2中);质粒pGADT7-Rec2的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端 768~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。Y187-pHis2系统酵母单杂原理:当猎物蛋白(Prey)结合到诱饵序列(BaitDNA)上,GAL4 AD就会激活 HIS的表达,能够在含有3-AT的培养基上生长,从而确定DNA和蛋白有相互作用。
本方案中检测诱饵酵母菌株的3-AT最佳使用浓度和互作验证都采用了稀释点板的方法,与涂板的方法相比,点板法能更直观的体现出DNA和蛋白的互作,还能减少培养基和3-AT的使用量。本方案还对常见的酵母单杂结果进行了分析。
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