产品属性

检测方法：

磷脂是细胞膜的主要成分，其种类和丰度在特定的微生物种类中维持相对的稳定，并具有遗传性。同时，死亡细胞的磷脂迅速降解，因此磷脂脂肪酸能够反应环境中具有生命活性的生物量的组成及其丰度。通过分离纯化样品中总的磷脂，然后通过甲酯化后进行脂肪酸甲脂组成和丰度分析，可以获得样品中处于活跃生命状态的微生物磷脂图谱（PLFA profile），进而分析样品的微生物群落组成和丰度特征。美国MIDI sherlock 微生物鉴定系统的PLFA模块是通过气相色谱仪的高灵敏FID检测器的采集数据，并采用系列脂肪酸甲脂作标准品进行质控，进而定量定性获得环境中复杂的磷脂脂肪酸组成信息。该系统已经广泛运用于各类检验机构和科研机构，作为全球通用微生物鉴定的标准方法之一被各个国家的海关，医院，疾控，商检及行业检测机构认证。

3.1 仪器与材料

Agilent 6890N，FID；氢气做载气

色谱柱：Agilent 19091B-102 (25 m×200 um× 0.33 um)

氮吹仪

十九酸甲酯（冷泉港生物科技股份有限公司）

磷脂商品固相萃取小柱（CNWBOND Si SPE Cartridge, 500 mg, 3 m1）

特氟龙离心管（50 ml）

试剂配制：

柠檬酸盐缓冲液：即柠檬酸钠缓冲液，0.15 mol/L，pH4.0

单相提取剂：柠檬酸盐：氯仿：甲醇=0.8:1:2（体积比）

甲醇甲苯混合液：甲醇：甲苯=1:1（体积比）

KOH-甲醇溶液：0.2 mol/L

其它色谱纯试剂包括氯仿、丙酮、甲醇、冰醋酸、正己烷、去离子水

3.2 操作方法

3.2.1 土壤预处理及冷冻干燥

1）将土壤样品过2 mm的筛子，去除杂物（客户端完成）；

2）将土壤样品取湿土约20 g到圆形铝盒中放入-80℃超低温冰箱预冻过夜；

3）将含有土壤样品的小铝盒放入Labconco* FreeZone冷冻干燥机进行真空冷冻干燥24小时；

4）取出后立即密封铝盖，放入4℃；若24小时内不用，则放入-80℃储存。

3. 2.2 总脂提取

1）取3 g干重土壤的土壤样品（根据经验值，一般森林，农田土壤为2-4 g; 陌生环境土壤需要做预实验以确定取样量），加入到特氟龙离心管中，注意避光加入20 mL单相提取试剂（氯仿：甲醇：柠檬酸=1:2:0.8）；室温下，2500 rpm高速混匀仪2小时；

2）取出离心管，放置于日立CR21GIII离心机，5000 rpm离心5分钟；

3）取上清到 18 mm× 180 mm玻璃试管，然后依次加入4.19 mL柠檬酸溶液和5.13 mL氯仿，静置过夜，分层；

4）吸取上层弃去，用长嘴吸管吸取下层氯仿相到18 mm×120 mm新玻璃试管中，用氮吹仪37°吹干，4℃保存；若24小时内不用，则放入-80℃储存。

3. 2.3磷脂分离

1）采用3 mL硅胶小柱分离磷脂。首先将硅胶小柱放置在Waters 20位固相微萃取装置上，然后依次向小柱中加入5 mL 氯仿进行活化；

2）取200μL的氯仿加入含有样品总脂的18 mm×120 mm玻璃试管，充分溶解后，用长嘴玻璃吸管移至已经活化的硅胶小柱上；转移三次，共900 μL；

3）依次用10 mL氯仿和10 mL丙酮分别洗去中性脂和糖脂；

4）用10 mL甲醇淋洗并用玻璃试管收集磷脂。将溶解在甲醇中的磷脂试管置于氮吹仪上37°吹干密封后放入-80℃保存。

3. 2. 4 磷脂甲酯化

1）在含有磷脂的试管中加入1 mL 甲苯甲醇混合液（甲苯：甲醇=1:1）和1 mL 的0.2 M 的KOH甲醇溶液（用甲醇配制），37℃水浴加热15 min；

2）反应结束后，加入2 mL ddH2O, 0.3 mL 冰醋酸，混匀；然后加入2 mL正己烷漩涡混匀30s，然后静置30 min，取上层正己烷相到2 mL 色谱进样瓶；

3）将色谱进样瓶放入氮吹仪进行浓缩至干燥；

3）重复步骤2-3一次；获得干燥的磷脂脂肪酸甲脂；

4）将保存有脂肪酸甲脂的色谱进样瓶盖紧盖子，4℃保存；若24小时内不用，则放入-80℃储存。

3. 2. 5 磷脂脂肪酸分析

取出保存有脂肪酸甲脂的色谱小瓶，加入200 μL

样品的磷脂脂肪酸分析采用美国MIDI Sherlock微生物鉴定系统平台的PLFA模块，以氢气为载气，以安捷伦Agilent 6890N气象色谱仪及FID检测器为硬件平台；色谱柱为Agilent 19091B-102 (25 m×200 μm× 0.33 μm)。每个样品进样量为1μL。根据MIDI平台规范，所有测试均采用标准品进行校正。

3. 2. 6 数据报告

   磷脂脂肪酸通常被分为：直链饱和脂肪酸（Straight）、支链饱和脂肪酸（Branched）、环丙基脂肪酸（Cyclo）,  DMA，甲基脂肪酸（10-methyl）,羟基脂肪酸（Hydroxy）单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）等。微生物分类标准请参考附件“磷脂脂肪酸类型及微生物类型分类标准”。

本实验对一份样品提供三份报告：sample.wgt为样品磷脂脂肪酸组成表；sample.fat为样品磷脂脂肪酸类型分类统计表; sample.bat为样品基于磷脂脂肪酸组成的微生物分类表。利用MIDI图谱识别软件Sherlock System 6.2进行样品脂肪酸图谱识别和分析。首先以内标C19的分子量为参照，将其他脂肪酸的响应值均一化，得到文件sample.wgt；然后以sample.wgt文件为基础，根据磷脂脂肪酸微生物分类表，将同一个样品的脂肪酸组成按照微生物类型进行归类；进一步根据磷脂脂肪酸类型分类表，将同一个样品的脂肪酸组成按照脂肪酸类型进行归类。

总磷脂脂肪酸或者单一磷脂脂肪酸的量的计算如下所示：

Nplfas(nmol/g)=（特定脂肪酸响应值 *C19甲酯摩尔数）/(C19：0响应值* 土壤干重)

本研究中，土壤干重被严格限定为3.00±0.05g; 每个磷脂脂肪酸的响应值被转换为pmol单位；200μL甲酯体系加入2μL  2.0 mg/mL C19甲酯；即

C _C19=2.0 mg/ml÷312 g/mol=6.4 mM

N _C19:0= 6.4mM*1 ul=6.4 nM

因此

N_plfas(nmol/g)=（Rplfas *6.4）/(R_C19* 3.0g)

其中Nplfa为特征磷脂峰的含量，Rplfas为特征磷脂峰的响应值；RC19为批次样品C19内标的响应值的平均值；如果计算总的磷脂的量即生物量，则Rplfas为总响应值。

备注：在检测数据EXCEL文件中，WGT是可识别的磷酸脂肪酸峰；FAT是按照脂肪酸类型进行的分类；BAT是按照微生物类型进行的分类。