项目总结 本项目采用 DIA 定量蛋白质组学技术开展课题研究，在 21 个样本中共鉴定到 蛋白质 9147 个，其中定量蛋白质 9147 个。按照表达倍数变化 1.5 倍以上（上 调大于 1.5 倍或者下调小于 0.67 倍）且 P value< 0.05 的标准进行显著性差异 表达蛋白质的筛选。以 A.vs.B 比较组为例，其中有 609 个蛋白质的表达水平 发生显著性变化，473 个蛋白质显著性上调，136 个蛋白质显著性下调（其它比 较对差异筛选数据详见：蛋白差异分析结果）。基于上述数据，对所有鉴定到的 蛋白质进行了系统的生物信息学分析(蛋白功能注释)，并对所有差异表达蛋白进 行了功能富集及蛋白互作网络分析。具体的工作流程和分析内容如下： 一、分析概述 数据非依赖性的扫描模式(Data-independent acquisition, DIA)是近几年来发 展的一种新的质谱数据采集方式[1]。可以依据质荷比（m/z）将质谱整个扫描范 围分为若干个窗口，然后对每个窗口中的所有母离子进行碎裂、检测，采集所有 母离子的碎片离子信息进行蛋白定性和定量。目前流行的蛋白质组学研究手段， 如 iTRAQ/TMT 、 Label-free 、 SILAC 采 用 的 都 是 数 据 依 赖 性 的 扫 描 模 式 (Data-dependent acquisition, DDA)，一级质谱进行全扫描采集母离子信号生成一 级谱图，二级质谱依次选择一级谱图中信号强度排序为 top10/20/40 的峰进行碎 裂并采集对应的子离子信息。 相对于 DDA，DIA 优势体现在： （1） 采集一级质谱 full scan 的全部母离子及对应的二级质谱子离子信息，具有更高的数 据覆盖度； （2） 二级质谱分“窗口”进行数据采集，减少数据采集的随机性，具有更高的检测重现性 和稳定性，适用于大批量样品的蛋白质组学分析； （3） 依靠多个循环的多个子离子对蛋白质进行定量，定量精密度、准确性、线性范围大 大提高； （4） 使用内标校正肽段（iRT KIT)对不同样品的保留时间进行校正，可对不同批次的样 品进行蛋白定量分析。 DIA 还具有以下特点： （1） 实验过程繁琐，对技术要求高，在 DIA 扫描前需要先用 DDA 构建一个真实的谱图 库 DDA library; （2） 二级谱图复杂，对解谱要求高。二、工作流程 1. 实验流程 从组织样品到最终数据获得的过程中，蛋白的提取、定量、检测、酶切与除 盐 [2]、馏分分离和质谱检测 [3]每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数 据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、 可靠性，诺禾致源对每一个实验步骤都严格把控，从根本上确保了高质量数据的 产出，流程图如下（具体实验步骤见附录）。2. 信息分析流程 一方面，对 DDA 扫描方式得到的下机谱图*.d 文件，通过 Spectronaut 软件 pulsar 模块进行搜库解谱，将谱图信息转化为蛋白质信息，同时进行 DDA 数据 质控，将数据导入 Spectronaut 构建出一个真实的谱图库 DDA library。另一方 面，通过 Spectronaut 将 DIA 扫描方式得到的下机谱图*.d 文件比对到 DDA library 进行蛋白鉴定。 将鉴定到的蛋白进行常见功能数据库注释，包括 COG 数据库、GO 数据库和 KEGG 数据库；接下来进行蛋白质的定量分析，包括鉴定到的蛋白质总体差异分 析和差异蛋白的筛选及表达模式聚类分析；最后针对筛选出来的差异蛋白进行 GO、KEGG 功能富集分析和互作网络分析等一系列的差异蛋白功能分析。若有其 他组学数据，比如转录组数据，可以进行转录组关联分析。