产品属性

中文名：辅酶Ⅱ NADP(H) 含量检测试剂盒 (WST-8, 微量法)

英文名：Coenzyme Ⅱ NADP(H) Content Assay Kit (WST-8, Micro Method)

纯度：BioReagent

货号：C1505573-96T

包装：96T

存储温度：避光,-20°C储存

产品介绍：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamideadeninedinucleotide phosphate，NADP）是很多氧化还原反应的辅酶，包括NADP+（氧化型）和NADPH（还原型）两种形式。NADP+也参与到生物合成反应中，比如脂质和核酸的合成。在动物细胞中，戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway，PPP）的氧化阶段是NADPH最主要的来源。NADP+/NADPH的测定主要应用于有关细胞或组织能量转化和氧化还原状态的研究中。 

检测原理：葡萄糖脱氢酶循环反应（不识别NAD+/NADH），在这一反应过程中生成的NADPH 将WST-8还原生成橙黄色的formazan（甲臜），在450nm左右检测有最大吸收峰，反应体系中生成的formazan与样品中总的NADP+或NADPH的总量呈正比关系。

检测范围：0.5-20 µM  

灵敏度：0.5µM

适用样本：动植物组织、细胞、细菌、血清（浆）

请在实验前检查各组分的量。 

各组分在规格基础上额外提供10%的量用于进行标准曲线制作或预实验。

自备仪器和试剂

实验流程

1、试剂准备

2、标准品配制

取2µL 10mM的NADPH加998µL Assay Buffer稀释为1mL 20µM NADPH预混液。按下表所示，进 行下一步稀释:

3、样品制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。当准备好进行该项实验时，将样本从-80℃拿出后，冰上解冻。但是请注意，这可能会影响样本的稳定性，实验结果可能会低于预期。为避免干扰实验，样本中应避免有如下物质存在：EDTA (>0.5mM)，ascorbic acid，SDS (>0.2%)，sodium azide，NP-40 (>1%)及Tween-20 (>1%)。

3.1 组织样本

冰上预冷的PBS洗涤组织后，称取约20mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中。

提取NADP：加入100µL NADP Extraction Buffer匀浆样本。煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）后加入20µL Assay Buffer和100µL NADPH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14000rpm离心 5min。将上清转移到新离心管，冰上待测。 

提取NADPH：加入100µL NADPH Extraction Buffer匀浆样本。煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）后加入20µL Assay Buffer和100µL NADP Extraction Buffer中和提取物。4℃，14000rpm离心5min。将上清转移到新离心管，冰上待测。

3.2 细胞或细菌样本

收集1×10⁶个细胞或细菌，用冷的PBS清洗细胞或细菌，800g离心2min 后弃上清。 

提取NADP：加入100µL NADP Extraction Buffer，超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）后加入20µL Assay Buffer和100µL NADPH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14000rpm离心5min，将上清转移到新离心管，冰上待测。

提取NADPH：加入100µL NADPH Extraction Buffer，超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s， 间隔7s，重复30次），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）后加入20µL Assay Buffer和100µL NADP Extraction Buffer 中和提取物。4℃，14000rpm离心5min，将上清转移到新离心管，冰上待测。

3.3 血清（浆）样本

提取NADP：吸取约20µL的血清（浆），加入100µL NADP Extraction Buffer，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）后加入20µL Assay Buffer和100µL NADPH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14000rpm离心5min，将上清转移到新离心管，冰上待测。

提取NADPH：吸取约20µL的血清（浆），加入100µL NADPH Extraction Buffer，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）后加入20µL Assay Buffer和100µL NADP Extraction Buffer中和提取物。4℃，14000rpm离心5min，将上清转移到新离心管，冰上待测。

4、实验步骤

4.1 酶标仪准备：预热30min以上，调节波长到450nm。 

4.2 工作液的配制：每孔配制85µL工作液，现配现用。吸取68µL Assay Buffer，1µL NADP Cycling Enzyme Mix，5µL WST-8，1µL Enhancer混合后，室温孵育5min，再加入10µL Glucose。 

4.3 检测体系配制：在96孔板中按照如下方式操作。该分析基于酶催化的动力学反应，工作液的加入需要迅速，各组分需要彻底混合。建议使用多通道移液器。标准孔和空白孔一般只做1次。

4.4 吸光度检测：充分混匀，测定450nm处的吸光值A1；室温孵育30min，再测定450nm处的吸光值A2。

5、结果计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。 

5.1 数据处理

计算ΔA=A2-A1，ΔΔA_标准=ΔA_标准-ΔA_空白，ΔΔA_测定=ΔA_测定-ΔA_空白。 

5.2 标准曲线绘制

以标准品浓度为y轴，ΔΔA_标准为x轴，绘制标准曲线。将ΔΔA_测定代入方程得到y值（µM）。 

5.3 样本NADP或NADPH含量计算

(1) 按样本质量计算

NADP或NADPH (nmol/g)=(y×V_样)÷(W×V_样÷V_样总)×n=0.22×y÷W×n

(2) 按细胞或细菌数量计算

NADP或NADPH (nmol/10⁴)=(y×V_样)÷(N×V_样÷V_样总)×n=0.22×y÷N×n

(3) 按液体体积计算

NADP或NADPH (nmol/mL)=y×(V_样总+V_提取)÷V_提取×n=12×y×n

(4) 按蛋白浓度数量计算

NADP或NADPH (nmol/mg prot)=(y×V_样)÷(V_样×Cpr)×n=y÷Cpr×n 

参数说明

nmol：1 μM=1 nmol/mL；

V_样：加入样本体积，0.04mL；

V_样总：组织样本总体积，0.22mL；

V_提取：血清（浆） 的体积，0.02mL；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； 

W：样本质量，g；

N：细胞或细菌数量，以10⁴为单位 （例如细胞数量为1×10⁶，N=100）；

n：样本稀释倍数。

6、结果展示

典型标准曲线：y=26.294x+0.0516，R²=0.9998

注意：在这些浓度下，NADP和NADPH的标准曲线是相同的。此说明书中，我们仅提供NADPH标准曲线。

常见问题及解答

Q：检测得到的样本ΔA_测定过高或者过低怎么办？ 

A：如果样本的ΔΔA_测定值高于20µM标准品的ΔΔA_标准值，将样本用去离子水进行稀释后，再进行实验。如果样本的ΔΔA_测定值低于0.5µM标准品的ΔΔA_标准值，增加样本量。

注意事项

1、正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

2、对于组织样本及细胞样本等，可通过测定蛋白浓度来进行样本间结果均一化。推荐使用阿拉丁B665595 BCA蛋白定量试剂盒或R1491648 即用型BCA蛋白定量试剂盒。

3、本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。

4、建议实验者自行建立标准曲线以提高结果准确度。如未自行建立标准曲线，可参考结果展示部分的典型标准曲线公式进行结果计算。 

5、生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。

6、本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

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