产品属性

中文名：Caspase 2 活性检测试剂盒

英文名：Caspase 2 Activity Assay Kit

纯度：BioReagent

货号：C1492383-20T

包装：20T

存储温度：2-8°C储存,避光,-20°C储存

产品介绍：

  半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物Caspase可分为三个功能组：启动子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9 和10），执行者半胱天冬酶（Caspase-3、6和7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-1、4、5、11 和 12）。Caspase-2 属于半胱氨酸蛋白酶家族，其仅在天冬氨酸残基后的氨基酸切割蛋白质。在这个家族中，Caspase-2是Ich-1亚家族的一部分，它是不同动物物种中最保守的胱天蛋白酶之一。它具有与启动子半胱天冬酶类似的氨基酸序列，包括Caspase-1，Caspase-4， Caspase-5 和 Caspase-9。它是作为酶原产生的，它包含一个与Caspase-9相似的长前结构域，并含有一个蛋白质相互作用域的CARD结构域。Caspase-2前体（Pro-Caspase-2）包含两个亚基，p19 和 p12。

  Caspase 2 活性检测试剂盒基于Caspase-2 水解肽底物 Ac-VDQQD-pNA（乙酰基-Val-Asp-Gln-Gln-Asp对硝基苯胺），产生黄色的对硝基苯胺（pNA），pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase-2的活性。
组分表

自备耗材
  酶标仪（能测405nm处的吸光度）
  96孔板
  低温离心机、制冰机
  可调节式移液枪及枪头
  去离子水、磷酸盐缓冲液（PBS）
  匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备果
1、Working Cell Lysis Buffer：使用前，立即加入DTT（最终浓度：每1mL Cell Lysis Buffer加10µL DTT (100×)），置于冰上；4℃保存。
2、Working Reaction Buffer (1×)：使用前，用去离子水稀释到Reaction Buffer (1×)，再加入DTT（最终浓度：每1mL Reaction Buffer (1×)加 10 µL DTT (100×)），置于冰上；4℃保存。
3、Ac-VDQQD-pNA (4 mM)：即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
4、pNA (10 mM)：即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
5、DTT(100×)：即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。
6、Standard 设置：按下表所示，用Reaction Buffer (1×，含DTT) 将标准品pNA (10mM) 稀释为200、100、50、25、12.5、0µM的标准溶液。

  注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
注意：我们建议使用新鲜样品。或按照“样本制备”将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。
1、通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个Caspase-2比色测定法设置不诱导的对照培养。
2、对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化收集细胞。600g，4℃离心5min，小心吸去上清液。用1mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×10⁶个细胞。
3、对于悬浮细胞，600 g，4℃离心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50µL Working Cell Lysis Buffer 中重悬 1-5×10⁶个细胞。
4、对于组织，将5-20 mg组织切成小块，用PBS清洗组织，加入0.1 mL Working Cell Lysis Buffer，冰浴匀浆。
5、裂解物冰上孵育15-20 min。
6、16,000 g，4℃离心15 min，然后将上清液转移至新试管中，置冰上待测。
7、立即测定Caspase-2的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。
实验步骤
1、酶标仪预热30min以上，调节波长到405nm。
2、操作表（下述操作在96孔板中操作）： 

空白孔、测定孔、对照孔：
混匀，37℃孵育1-2h，检测405nm处吸光值。
空白孔记为A^空，测定孔记为A^测，对照孔记为A^对。
计算ΔA^测=A^测-A^空。
仅组织样本需要设置对照孔，对于组织样本，ΔA^测=A^测-A^对。
标准孔：
立即检测405nm处吸光值，计算ΔA^标=A^标-A^Std.6，A^Std.6为不含pNA的标准孔的吸光值。
注意：
1、空白孔和标准孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；
2、对于组织样本，样本本身有颜色，需要设置对照孔，细胞样本一般不需要设置对照孔；
3、在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；
4、发现颜色变化比较明显时即可测定405nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间至4h。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1、按标准曲线计算
以标准溶液浓度为x轴，ΔA^标为y轴，绘制标准曲线y=kx+b。将样本的ΔA^测带入方程得到x值（μM）。
2、按酶活性增加百分比计算
Caspase-2 活性增加百分比=(实验处理组A^测定-A^空白)/(实验对照组A^测定-A^空白)×100%
该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。

3. 按酶活计算
参考Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在 37℃一个小时内可以剪切1nmol pNA底物产生1nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase酶活性。
Caspase-2 活性（U/mg prot）=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×10³=2.1×x÷Cpr÷T
V反总：反应体系总体积，0.105mL=1.05×10⁻⁴L；
V样：加入的样本体积，0.05mL；
T：反应时间，h；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
10³：单位换算系数，1μmol=10³nmol。
注意：对于样品中Caspase-2酶活力特别高的情况，须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数n。
结果展示
经典标准曲线——以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

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