产品属性

Cas14a (Cas12f1) 蛋白说明书

【产品名称】Cas14a (Cas12f1) 蛋白

【表达系统】 E.coli大肠杆菌

【分  子  量】62kDa                   

【产品内容】：

【储存条件及有效期】

-20℃保存。收到产品后，建议分装保存，避免反复冻融。

【检验原理】

Cas14a蛋白，又称 Un1Cas12f1核酸酶，属于Type V-F CRISPR-Cas系统的小型RNA引导核酸酶。其在tracrRNA:crRNA（或sgRNA）的引导下，特异结合并切割靶标ssDNA，且无需PAM位点。与Cas12a类似，Cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssDNA反式切割活性，从而被应用于靶标核酸的分子检测；与Cas12a不同的是，Cas14a只能结合ssDNA靶标，因此经过扩增富集的靶标核酸需使用T7核酸外切酶进行处理，且其中一条扩增引物需要使用磷硫酰化修饰以确保T7核酸外切酶仅切割其中一条链，从而留下ssDNA靶标链以用于Cas14a介导的分子检测。

【Cas14a sgRNA】

Cas14a sgRNA由tracrRNA, crRNA和Spacer 构成。sgRNA与Cas14a结合，形成功能复合物，被目标序列特异性激活。推荐搭配CRISPR guide RNA转录试剂盒制备sgRNA.（Cat.: SG-RNA-001）

Cas14a sgRNA scaffold sequence结构序列: 5’-3’:

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【应用示例】

1. 根据下表配置Cas14a切割反应体系：（建议冰上操作）

*可用 1X Diluent Buffer 稀释， 稀释后需立即使。

**Target DNA 可为 ssDNA 或带 PAM 序列的 dsDNA，Positive Control包含sgRNA、Reporter和ssDNA，20μL反应体系加入5μL。（crRNA、Target DNA 及ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释。对于极低浓度的 Target DNA，建议用 0.1% Tween 20 稀释并使用低吸附的离心管、 吸头等耗材。）

***推荐 EZassay^TM Reporter for Cas14a。 (Cat.#: DNA-FAM-BHQ-L)它带有FAM荧光标签。

2. 设置Q-PCR 仪温度为37℃， 每分钟采集一次荧光信号。

【结果示例】

【注意事项】

1. 如果使用Q-PCR仪，请关闭热盖功能或将热盖温度设置为40°C。

2. Cas14a的顺式剪切(cis-cleavage)： Cas14a在 sgRNA 的引导下， 特异性地剪切 target DNA。 dsDNA 靶标需带有 PAM 位点， 而 ssDNA 靶标不依赖 PAM 位点。

3. Cas14a的反式剪切(trans-cleavage)： 当 target DNA 存在时， Cas14a/sgRNA 与 target DNA 形成复合物， Cas14a被激发反式剪切活性，将反应体系中任意序列的单链 DNA切割。

4. 当 Cas14a 结合靶标 ssDNA 时，需使用 T7 核酸外切酶对扩增得到的靶标 dsDNA 进行消化，得到靶标 ssDNA，用于 Cas14a 介导的分子检测。（注意：其中一条扩增引物需要采用磷硫酰化修饰以确保 T7 核酸外切酶仅切割另外一条链， 从而留下ssDNA 靶标链。） 

5. 请保持实验区干净整洁， 操作时需穿戴干净的手套、 口罩， 实验所用枪头、 离心管等耗材均为 RNase-free。