生物有效磷（酶磷、盐酸磷、氯化钙磷、柠檬酸磷）

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生物有效磷（酶磷、盐酸磷、氯化钙磷、柠檬酸磷）

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货号：TRLH-25

品牌：科锐思博生物

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检测方法：

3.1 提取试剂的配置：

CaCl₂（0.01mol/L）：称取1.11g无水CaCl₂溶于双纯水（电阻>18.2 Ω），定容至1L；

柠檬酸（0.01mol/L）：称取2.1g无水柠檬酸溶于双纯水，定容至1L；

酶（Eu/ml）：称取0.04g磷酸酶(Sigma P3627)+0.66g植酸酶(sigma p1259)溶于40ml双纯水。剪20cm左右透析膜用热水煮沸10min，捞出用双纯水洗净，将配置溶液装入透析膜中夹好。置于盛有双水的烧杯中，每天换水，透析一周后，定容至1L。

HCl（1mol/L）：量取85.9ml浓盐酸于900ml双纯水，定容至1L。

3.2 底物（Mix）的配置：

试剂1：量取24 ml浓硫酸于120 ml双纯水中，冷却后，加孔雀石绿0.176g，溶解；

试剂2：称取7.5 g钼酸铵溶于100 ml双纯水中；

试剂3：用移液枪吸取1.1 ml吐温20于8.9 ml双纯水中。

Mix=试剂1（10 ml）+ 试剂2（2.5 ml）+ 试剂3（0.2 ml）

3.3 提取样品：

平行称取混匀的鲜土样0.25 g于4个15 ml离心管中，在4个离心管中分别加入5 ml 0.01M CaCl₂、10ml 0.01 M柠檬酸溶液、10 ml 0.02 Eu/ml酶溶液、10 ml 1 M 盐酸溶液，封口后于震荡机中震荡3h（180 rpm，25℃）。震荡后充分摇匀。将枪头伸到离心管2/3深度位置处吸取1 ml混合液于1.5 ml离心管中，离心1 min （10000 rpm，25℃）。

3.4 酶标板显色及上机测定：

CaCl₂-P显色：50μm 混合试剂（Mix）+200μm Cacl₂-P上清液；

	0	1	2	3	3	4	6	7	样本
磷标准溶液（2mg/L）（ul）	0	2.5	5	7.5	10	12.5	15	25	200
氯化钙（ul）	200	197.5	195	192.5	190	187.5	185	175	0
MIX试剂（ul）	50	50	50	50	50	50	50	50	50
磷浓度mg/L	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1	0.12	0.2

柠檬酸-P显色：50μm混合试剂（Mix）+180μm双纯水+20μm柠檬酸-P上清液；

	0	1	2	3	3	4	6	样本
磷标准溶液（2mg/L）（ul）	0	2.5	5	7.5	10	12.5	15	20
柠檬酸（ul）	20	17.5	15	12.5	10	7.5	5	0
MIX试剂（ul）	50	50	50	50	50	50	50	50
水（ul)	180	180	180	180	180	180	180	180
磷浓度mg/L	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1	0.12

酶-P显色：50μm混合试剂（Mix）+200μm酶-P上清液；

	0	1	2	3	3	4	6	7	样本
磷标准溶液（5mg/L）（ul）	0	2.5	5	7.5	10	12.5	15	25	200
酶溶液（ul）	200	197.5	195	192.5	190	187.5	185	175	0
MIX试剂（ul）	50	50	50	50	50	50	50	50	50
磷浓度mg/L	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.5

HCl-P显色：50μm混合试剂（Mix）+190μm双纯水+10μm HCl-P上清液。

	0	1	2	3	4	5	6	样本
磷标准溶液（2mg/L）（ul）	0	2	3	5	6	8	10	10
盐酸（ul）	10	8	7	5	4	2	0	0
MIX试剂（ul）	50	50	50	50	50	50	50	50
水（ul)	190	190	190	190	190	190	190	190
磷浓度mg/L	0	0.016	0.024	0.04	0.048	0.064	0.08

25℃条件下显色1h后，于酶标仪中（波长630nm）测定。

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