真菌基因组测序

真菌属于较低等的真核生物，种类繁多，在自然界中分布广泛。据估计，全世界约有150万种真菌，其中包含许多具有重要药用价值和食用价值的有益真菌，同时也存在着大量能引发动植物病害的致病菌。因此，合理利用有益真菌，控制和预防有害真菌，对人类的生产和生活具有重要的意义。而真菌基因组的阐明，将为真菌特性的分析提供重要依据。随着高通量测序技术的成熟，基因组测序成本已大大降低，使得快速而经济的进行真菌基因组测序成为可能，目前真菌基因组学研究已经进入了一个快速增长时期。

美吉优势

拥有交互式真菌基因组云平台，分析内容全面，数据交付快速，性价比更高；

拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台，实验周期短，质量可靠；

拥有多种测序平台和强大的计算机资源，提供最佳的测序解决方案和快速的数据分析平台；

技术人员经验丰富，可根据客户需求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果；

拥有专业的生物信息团队，可提供个性化的生物信息分析服务；

产品类型

1.真菌基因组扫描图

构建Illumina PE（~400bp）文库，通过Illumina Hiseq平台测序并进行de novo基因组组装，初步获得基因组序列和功能注释信息。

2.真菌基因组精细图

构建Illumina和Pacbio文库，通过Illumina和Pacbio Sequel平台测序并进行de novo基因组组装，获得基因组精细图并进行深度生物信息挖掘。

实验流程

生信分析

技术参数

1.承诺指标

（1）样本要求：单核体；重复序列占基因组总大小的0.5%以下；基因组杂合度小于0.5%；不存在共生微生物；

（2）Illumina平台：每个样品提供约定的测序量，测序质量Q30达到80%以上，整体测序覆盖深度不低于100倍，基因组单碱基错误率平均低于十万分之一；

（3）Pacbio平台：scaffold N50＞1M，单碱基错误率平均低于十万分之一。

2.项目周期（从质检合格到标准分析结束）

真菌扫描图：35个自然日；

真菌精细图：55个自然日。

3.送样要求

1）样品类型：DNA/菌体；

2）菌体样品需求量：

培养收集单核的真菌组织；菌体培养不要太晚，最好在未产生菌丝或者菌球之前收集菌液，菌液离心富集弃去上清后送沉淀，2ml离心管装满3管送样（具体操作：离心后弃掉上清，继续离心菌液到原离心管中，弃上清直至装满）；

将装有菌体沉淀的离心管在干冰/冰袋条件下寄送，或是暂时存放于-80℃后再干冰/冰袋寄送。另送1-2份样品备份；

如样品是从自然界中直接分离的真菌组织，如食用真菌，尽量采集新鲜样品，将组织置于75%乙醇中进行消毒（时长根据组织的大小及生长换将而定），然后用ddH₂O漂洗数次，洗去污渍及残留的乙醇，采用干冰寄送；

3）DNA样品需求量：

扫描图基因组DNA：双链DNA总量≥1μg，浓度≥20ng/µL，OD260/280=1.8-2.0，OD260/230=1.8-2.2；DNA的主峰带明显且在2kb以上，无明显RNA污染；

精细图基因组DNA：双链DNA总量≥15μg，浓度≥50ng/µL，OD260/280=1.8-2.0，OD260/230=1.8-2.2；DNA的主峰带明显且在15kb以上，无明显降解，无明显RNA污染；

为了避免DNA样品的降解，寄送过程中务必保证足够的干冰/冰袋，避免样品反复冻融，送样时注明溶剂组分；

注：老师在拿到DNA胶图后，如不确定样品是否合格，可在送样之前先将胶图发送到mdna@majorbio.com，由技术人员评估确认后再进行样品寄送；病原微生物只接受DNA样本。

案例解读

美吉客户文献案例一：红毛癣菌和紫毛癣菌基于基因组的系统进化分析^[1]

红毛癣菌和紫毛癣菌是人类皮肤真菌感染的常见病原菌，前者可感染皮肤和指甲，而后者仅感染头皮。这两个物种在表型上不同，但在系统遗传学上高度相似。文章基于ITS、LSU、TUB2、EF3、RP 60S L1和全基因组序列，将分子系统发育和生态数据结合起来，重新进行皮肤真菌的系统分类。结果发现Trichophyton rubrum和Trichophyton Violaceum序列有99%的同源性，表型的差异可能是由于一些特有基因、分泌蛋白、黏附素、代谢途径的差异导致的。

图一：基于ITS的进化分析

图二：基于ITS、LSU、TUB2、EF3、RP 60S L1的进化分析

图三：基于全基因组的进化分析

参考文献：

[1]Zhan P , Dukik K , Li D , et al. Phylogeny of dermatophytes with genomic character evaluation of clinically distinct, Trichophyton rubrum, and, T. violaceum[J]. Studies in Mycology, 2018:S0166061618300071.

常见问题

(1)真菌中样本制备有哪些注意事项？

对于易降解的部分样品，建议在公司提取完之后，立即建库上机，从而避免样品降解，如白粉菌等；

对于难以培养的部分菌株，得到的样品量较少，不够正常文库建库，可以进行微量建库或全基因组扩增，如黄绿蜜环菌等；

对于难以抽提的部分样品，可根据实际情况选择CTAB、试剂盒法或者相关文献中方法，送样建议送单核体、或是纯合双核体。

(2)如何制定真菌基因组de novo测序策略？

真菌基因组的重复序列、GC含量、杂合率、染色体数目等是影响基因组de novo拼装效果的关键因素，如果待测菌株基因组或其近源物种基因组已有报道，可以根据已报道的基因组信息分析待测菌株重复序列、GC含量、杂合率、染色体数目等特点，制定合适的测序策略。