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16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上,包括 10 个保守区域(Conserved Regions)和 9 个高变区域(Hypervariable Regions), 其中保守区在细菌间差异不大,高变区具有属或种的特异性,随亲缘关系不同而有一定的差异。因此,16S rDNA可以作为揭示生物物种的特征核酸序列, 被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。16S rDNA扩增子测序(16S rDNA Amplicon Sequencing),通常是选择某个或某几个变异区域,利用保守区设计通用引物进行PCR扩增,然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定,16S rDNA扩增子测序技术已成为研究环境样本中微生物群落组成结构的重要手段(Caporaso et al.,2011; Youssef N et al.,2009; Hess M et al.,2011)。
随着高通量测序平台的不断发展,升级后的NovaSeq测序平台可实现双端测序的PE250策略,达到与MiSeq平台相近的读长,并且在通量和测序质量上比MiSeq有了很大的提升,成为更适用于16S扩增子测序的新平台。NovaSeq PE250测序通量高、深度大,更有利于低丰度群落物种的鉴定,从而提高微生物群落研究的完整性,因此将会成为研究微生物群落多样性的首选之策。
根据所扩增的区域特点构建小片段文库,并基于illumina NovaSeq测序平台对文库进行双末端测序。经过Reads拼接过滤,OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类或ASVs(Amplicon Sequence Variants)降噪,随后对得到的有效数据进行物种注释以及丰度分析,从而揭示样本物种构成;而进一步的α多样性和β多样性分析,不仅可以挖掘样本间群落结构的差异,而且还可以根据项目需求进行个性化分析和深度的数据挖掘。
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